MotDB


AJACS10/neta のバックアップの現在との差分(No.2)


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#contents

[[AJACS10]]に戻る
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-[[データベースを使いこなすためのコンピュータ・ウェブの基本的な使い方>./basic]]
-[[統合データベース>./togo]]
-[[文献データベース>./paper]]

*ホモロジー検索(BLAST) [#o7198fd5]
**データベース [#v379de9e]
-DNA塩基配列
--[[GenBank>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/]]/[[EMBL>http://www.ebi.ac.uk/embl/]]/[[DDBJ>http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html]], [[RefSeq>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/]]など
---[[GenBankエントリの例>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=NM_000558]]
---現在は[[A型インフルエンザの配列を集めたページ>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/SwineFlu.html]]も提供されています 
-アミノ酸配列
--Swiss-Prot, trEMBL, [[UniProt>http://www.uniprot.org/]]など
---[[UniProtエントリの例>http://beta.uniprot.org/uniprot/O14548]]
-[[世界中の代表的なデータベース・ツール>./DB]]
-[[ホモロジー検索(BLAST)>./BLAST]]
-[[マルチプルアラインメント>./ClustalW]]
-[[モチーフ検索>./motif]]
-[[ゲノムブラウザ>./gb]]
-[[遺伝子発現解析>./expression]]
-[[パスウェイ解析>./pathway]]
-[[タンパク質立体構造>./structure]]

**ツール [#l0590274]
//**アミノ酸配列のアラインメント [#f7b2516b]
//***「マトリクス」=類似の程度を示す [#j18f41ca]
//-PAM250
//-BLOSUM62
-''その他''↓
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#contents
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//***ダイナミックプログラミング = DP [#kb9a11e1]
//-「最適経路中の部分経路もまた最適経路になっている」
//-動的計画法は、この原理を利用して最適化問題を解く。
//-ある問題を、多段階に「バラす」ことができる場合、動的計画法によって各段階の最適解(経路)を求め、それをたどることで、全体の問題を解くことが可能になる。
*機能アノテーションの方法 [#mc4a12b2]
#ref(AJACS10.008.jpg)

//***まじめにDPやるとタイヘンなんで、はしょる [#zba85d5e]
-SSEARCH
--配列全体を探索
-FASTA
--よく似た領域の周囲だけを探索
-BLAST
--「ワード」の一致を発見
--そこからアラインメントを横へ伸ばす。伸びなくなったらあきらめる。
--きわめて高速で巨大配列も探索可能
-BLAST検索のprogram option
*現在進行中のゲノムプロジェクトを調べる 〜GOLDデータベース〜 [#ba426fce]

|program|入力|DB|概要|
|BLASTN|DNA塩基配列|DNA塩基配列|入力配列(DNA塩基配列)と類似の核酸配列を検索|
|BLASTP|アミノ酸配列|アミノ酸配列|入力配列(アミノ酸配列)と類似のアミノ酸配列を検索|
|BLASTX|DNA塩基配列|アミノ酸配列|入力DNA塩基配列をアミノ酸に翻訳した配列で、類似のアミノ酸配列を検索|
|TBLASTN|アミノ酸配列|DNA塩基配列|入力アミノ酸配列を、DNA塩基配列のデータベースをアミノ酸配列に翻訳したものに対して、類似の配列を検索|
|TBLASTX|DNA塩基配列|DNA塩基配列|入力DNA塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したものを、核酸配列データベースをアミノ酸配列に翻訳したものとの類似を検索|
|PSI-BLAST|アミノ酸配列|アミノ酸配列|入力配列とアミノ酸データベースとの検索を繰り返すことで、弱い類似しかない配列を検索可能にする方法|
|PHI-BLAST|アミノ酸配列|アミノ酸配列|配列の「パターン」で類似の配列を検索する|
#ref(AJACS10.060.jpg)

これらのプログラムはもともと自分の使えるサーバやパソコンにインストールして使うものですが、BLASTなんかはウェブ経由でも使えるようになっています

**【実習】BLAST検索 [#jeff5520]
-統合TV: http://togotv.dbcls.jp/20070808.html

-今回はBLASTを使って機能未知のアミノ酸配列の機能を推定してみましょう。

+以下の配列をコピーします (control-C)
--書き写すのは大変な上に必ず打ち間違えますので、やめましょう
// >opsin Rh2(Drosophila melanogaster)
 MERSHLPETPFDLAHSGPRFQAQSSGNGSVLDNVLPDMAHLVNPYWSRFAPMDPMMSKIL
 GLFTLAIMIISCCGNGVVVYIFGGTKSLRTPANLLVLNLAFSDFCMMASQSPVMIINFYY
 ETWVLGPLWCDIYAGCGSLFGCVSIWSMCMIAFDRYNVIVKGINGTPMTIKTSIMKILFI
 WMMAVFWTVMPLIGWSAYVPEGNLTACSIDYMTRMWNPRSYLITYSLFVYYTPLFLICYS
 YWFIIAAVAAHEKAMREQAKKMNVKSLRSSEDCDKSAEGKLAKVALTTISLWFMAWTPYL
 VICYFGLFKIDGLTPLTTIWGATFAKTSAVYNPIVYGISHPKYRIVLKEKCPMCVFGNTD
 EPKPDAPASDTETTSEADSKA
+NCBI BLASTのページを開きます: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/
--右クリックから「新しいタブで開く」(or 新しいウインドウを開く)を選択して別のタブで開くと便利です
--NCBI: National Center for Biotechnology Information 米国国立生物工学情報センター
+「protein blast」を選択します
--アミノ酸配列が入力で、アミノ酸データベースに対して検索を行います
+「Search」窓に上記配列をペーストします (control-V)
+「Choose database」で「swissprot」を選択
--検索対象としてどのデータベースを選ぶかは非常に重要です。解析の目的に合わせて適切なデータベースを選びます
--今回は機能未知配列の(なるべく)正確な機能を推定したいので、人手で整備されている(データがきれいな)swissprotを選びました。
+Algorithm が blastp (protein-protein BLAST) になっているのを確認する
+「BLAST」ボタンをクリック → これで計算が始まります
--結果の一番上に、Conserved Domain(機能が共通しているタンパク質で保存されている領域)が表示されます 
--実行が遅いときはこちら:[[あらかじめ検索した結果>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Get&VIEW_RESULTS=FromRes&RID=0REWVY3W016&UNIQ_OBJ_NAME=A_SearchResults_1M4UXG_3hkf_1Z9x5s21o_GTSlj_1y7wld&QUERY_INDEX=0]]
//--計算している間(モノによっては結構時間がかかります)、The Conserved Domain Database (CDD)  が表示される
//--すぐ計算が終わった場合は表示されない。→ 結果ページの右上にある「Show Conserved Domains」をクリックすることで表示できる。
+画像の7tm_1をクリック
//(もしくはページの右上にある「Show Conserved Domains」をクリック)
--conserved domainとして「pfam00001, 7tm_1, 7 transmembrane receptor (rhodopsin family)..」が見つかった(7回膜貫通型receptor; Pfam00001)
---どういうドメインを持っているかで大体の機能の予測ができることも多いです
+戻って、検索の結果を見てみます
--まずアラインメントされた(並べることのできた)領域の絵が出力されています
--その下にヒットしてきた配列のリストとスコア、E-valueが表示されます
---E-valueとは、そのライブラリで偶然に同じスコアでヒットする''本数''の期待値
--配列リストの右の「G」は「Entrez gene (遺伝子ごとに情報をとりまとめたデータベース)」へのリンク
---どのような情報がとりまとめられているか、確認してみましょう
--さらに下の方に行くと、配列のアラインメントを見れます

***計算結果をいろいろな方法で表示 [#ddee5775]
-結果上部にある「Formatting options」から結果を別の書式で表示させることができます。
-結果上部にある「Download」から結果を別の書式で表示させることができます。

-【応用】テーブル形式で結果を保存し、エクセルで開いてみよう
+「Download」をクリックします
+「Alignment」のしたにある「Hit Table(text) 」をクリックします
--デスクトップとかに保存します
--保存したファイルはテキストファイルなので、「メモ帳」とかでも開けます
+Excelを起動します
+「ファイル」→「開く」からさきほどダウンロードしたファイルを開きます
--ファイル名は「なんたらかんたら-Alignment.txt」
--ファイルが灰色になって選択できない場合には、「選択対象」とやらを「すべての読み込み可能なファイル」から「すべてのファイル」に変更します
+「カンマやタブなどの〜」を選んで「次へ」
+区切り文字 のところで、「タブ」と「コンマ(カンマ?)」両方にチェックを入れます → 「次へ」
+「完了」を押すとBLASTの結果をExcelで表示できました


//-【参考】: cDNAやESTのゲノムへのマッピング(貼り付け)は、BLATのほうがよい&br;
//のちほど「真核生物のスプライスサイト予測」で利用します。結果の見え方や速度を比較しましょう

//-系藤樹を表示させよう
//--下へスクロールして「Alignments」の上から順に数本にチェック入れる
//--「Distans tree of results」をクリック
//--「Tree Method」を「Fast Minimum Evolution」から「Neighbour joining」に変更したり、樹型を「rectangle」から「slanted」「radial」などに変更してみましょう

-【応用】: 検索結果で得られた類似な配列をFASTA形式でまとめどりしよう
--統合TV: http://togotv.dbcls.jp/20070926.html

+結果ページの「Alignments」(リストの下)のところに、それぞれの配列の先頭にチェックボックスがあるので、欲しい配列にチェックを入れます
--全部欲しい場合には「Select all」をチェックすれば全部の配列にチェックが入ります。もう一回押せばチェックを解除できます
+今回は上から5個の配列にチェックを入れてみます
+「Select all」の横にある「Get selected sequences」を押します
+上の方にある「Display: Summary」のところを「FASTA」に変更します(自動的にページが更新されます)
//--20個以上のすべての配列が表示されるように、右側の数字の部分を変更します(自動更新)
+「Send to」のところを「File」に変更します(自動的に配列をダウンロードします)
+メモ帳でダウンロードしたファイルを開きます

***その他の機能 [#k440c1fc]
-【応用】: PSI-BLASTを使うと、何回も繰り返し検索を実行することで類似が低いが遠縁であるような配列を捕まえることもできます。上記の配列で実行してみましょう。
--統合TV: http://togotv.dbcls.jp/20071016.html

+新しく[[BLAST>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/]]のサイトを開きます
--前の配列が残っている場合には入力ボックスの上にある「Clear」を押して前の配列を消してから実行します
+配列を入力ボックスにコピペし、検索対象データベースを確認します
+「Algorithm」のところを「PSI-BLAST (Position-Specific Iterated BLAST)」に変更します
+「BLAST」ボタンをクリック
--表示される結果が1回目のPSI-BLASTの結果です(1回目の結果は blastp の結果と同じになります)
+「Descriptions」(絵の下)にある「Run PSI-Blast iteration 2 with max 500」の横にある「Go」をクリックすると2回目の検索が始まります
--「Descriptions」のところで New マークが付いている配列が新しく見つかった配列です

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*現在進行中のゲノムプロジェクトを調べる 〜GOLDデータベース〜 [#ba426fce]
-[[GOLD: Genomes OnLine Database>http://www.genomesonline.org/]]
--世界中で行われた/行われているゲノムプロジェクトを集めたデータベース
-統合TV: http://togotv.dbcls.jp/20090403.html

-【演習】:解読が終了したゲノムプロジェクト・現在進行中のゲノムプロジェクトを調べてみましょう
--真ん中にある「GOLD Tables」をクリックすると、終了したゲノムプロジェクトの数と、それぞれの生物ドメイン(真核/真正細菌/古細菌)で進行中のゲノムプロジェクト数が見れます

--すでに終了しているプロジェクトはいくつありますか?
--真核生物で現在進行中のゲノムプロジェクトはいくつありますか?
--真正細菌、古細菌で進行中のプロジェクトはいくつありますか?

---真核生物:Eukaryote (E)
---真正細菌:Bacteria (B)
---古細菌:Archaea (A)

-メタゲノムプロジェクト(ある場所にいる生物のゲノムをまとめて読む)の数も見れます
--どのような場所の生物集団が対象になっていますか?調べてみましょう

-【演習】:あの生物(犬とかネコとか)のゲノムは読まれているか?調べてみよう。
--まず、調べたい生物の学名(ヒトの場合だとHomo sapiens)を調べます
---catとかdogのような一般名では調べられません
---大抵[[WikiPedia>http://ja.wikipedia.org/]]とかに載ってます
---NCBIの[[taxonomy>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/]]とかでも調べられる

--「属」の部分(ヒトの場合だと Homo)をコピーします
---sapiensの部分は「種」といいます

--GOLD Tablesの真ん中へんに「Search GOLD」というのがあるのでクリック
---「Genus」(属)の部分にペーストして「Submit search」をクリックすると検索できます
---「species」(種)も指定できますが、検索条件をきつくしすぎると、結果が帰ってこないかもしれません

--調べたゲノムプロジェクトは終了していましたか?進行中でしたか?それとも誰もやっていない?

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*[[GO: Gene Ontology>http://www.geneontology.org/]] [#i6e4677f]

[[工事現場>./construction]]
#ref(AJACS10.063.jpg)
#ref(AJACS10.064.jpg)

-&color(green){遺伝子機能を説明するための用語集で階層構造になっています。evidence が明記されているのはすばらしいこと}
--biological process: 生物学的プロセス
--cellular component: 細胞の構成要素
--molecular function: 分子機能

-エビデンスコード(信頼性基準)
--IDA: Inferred from Direct Assay
--IMP: Inferred from Mutant Phenotype
--ISS: Inferred from Sequence or Structural Similarity
--RCA: inferred from Reviewed Computational Analysis
--TAS: Traceable Author Statement
--NAS: Non-traceable Author Statement 
--IEA: Inferred from Electronic Annotation
などなど

-入力ボックスに遺伝子名やGOの用語を入力して検索できます

-【演習】:「amylase」を「GO term or ID」から検索してみましょう
--用語中に「amylase」を含んでいるGO用語がリストされます
--一番上の「amylase activity」をクリックすると
---all : all  [251269 gene products]
---GO:0003674 : molecular_function [164180 gene products]
---GO:0003824 : catalytic activity [48760 gene products]
---GO:0016787 : hydrolase activity [15758 gene products]
---GO:0016798 : hydrolase activity, acting on glycosyl bonds [1346 gene products]
---GO:0004553 : hydrolase activity, hydrolyzing O-glycosyl compounds [1008 gene products]
---GO:0016160 : amylase activity [69 gene products]

--という階層構造を持ち、現在その中には69個の遺伝子が登録されていて、

--「[69 gene products]」の部分をクリックすると、登録されているそれぞれの遺伝子が「amylase activity」を持つ、とされた根拠が信頼性(エビデンスコード)とともに表示されます


+【演習2】:キーワード「DNA binding circadian」で検索してみよう
++結果のなかから CCA1, CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 をクリックして遺伝子の詳細を見る
++上部の「5 term associations→」リンクを開いてGene Associationとevidence codeを閲覧
++GO:0007623 の「circadian rhythm」をクリックして[[GeneOntology>http://www.geneontology.org]]の詳細を見る
++Term Lineageの「circadian rhythm [243 gene products] 」のリンクをクリックし、
++このタームに関連する遺伝子のリストを表示する&br;
【ここでも、それぞれのevidence codeに着目してみよう】
++Evidence CodeをIDA (Inferrd from Direct Assay) に限定するfilterをかけてみる
++speciesをA. thalianaに限定してみるなどの操作を行ってみる
++IDA, TASなど、複数のEvidence codeの選択も可能。Macならcommand key+クリック,windowsの場合はCtrlかShiftあたりか?

-【発展】: Evidence Codeの詳細を[[Guide to GO Evidence Codes>http://www.geneontology.org/GO.evidence.shtml]]を参照して確認しよう。あなたにとって信頼に足るcodeはどこまでか
 

//**[[CyanoGenes:http://bacteria.kazusa.or.jp/cyanobase/Synechocystis/comments/]] [#v0863dd0]

//&color(green){シアノバクテリアの遺伝子単位のコメント受付。オープンアノテーションの最初期の試み};

//>http://www.kazusa.or.jp/cyanobase/Synechocystis/comments/

//-【実習】: それぞれの遺伝子にどんなコメントがついているか、確認してみよう


//**[[KazusaAnnotation:http://a.kazusa.or.jp]] [#ca5bb518]

//&color(green){統合DBプロジェクトにおける、オープンアノテーションへの挑戦。現在進行形};

//>http://a.kazusa.or.jp

//-【実習】: それぞれの遺伝子にどんなブックマークとコメントがついているか、確認してみよう

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*コンピュータ上でベクターに遺伝子を導入する [#v46ca7d7]
-EMBOSSのtranseq, revseq
-Primer3
-NEBcutter
--を使ってベクターへの遺伝子導入をコンピュータ上のシミュレーションする

#ref(AJACS10.049.jpg)
#ref(AJACS10.050.jpg)
#ref(AJACS10.051.jpg)

-酵母(Saccharomyces cerevisiae)のost4という遺伝子の全長を発現ベクターに導入してみる(Ost4タンパク質は34アミノ酸残基からなるとても短いタンパク質です)

-演習用配列1(coding sequence)
 >YDL232W  Chr 4  
 ATGATCTCTGATGAACAGCTGAACTCCTTGGCCATCACCTTCGGTATTGTGATGATGACT
 TTAATTGTCATTTACCATGCTGTTGACTCCACCATGTCTCCTAAGAACTAA

**[[EMBOSS>http://emboss.sourceforge.net/]] [#v3687d63]
-200以上の配列解析ツールを収録したプログラム集
-左側からツールをクリックしたときに、右側の画面のツール名の下に出る(read the manual)をクリックすると、ツールの説明やオプションの説明、実行例などが見れます(英語ですが・・・)

**transeq でDNA配列をアミノ酸に翻訳してみる [#gd1b21d1]
-統合TV:[[transeqで塩基配列をアミノ酸に変換する>http://togotv.dbcls.jp/movie/071120transeq_f.html]]

-[[transeq (EBI)>http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/transeq/index.html]]

-[[EMBOSS Explorer @ DBCLS>http://emboss.dbcls.jp/]]

--Frame(s) to translate で翻訳するフレームを選択します
--- 1:入力した配列を最初から翻訳していきます
--- 2:2番目の塩基から翻訳を開始します
--- 3:3番目の塩基から翻訳を開始します
--- Foward three frames:上記3つの翻訳を一度に実行します
--- -1:入力した配列の相補配列を最初から翻訳していきます(入力した配列の最後から翻訳されます)
--- -2:入力した配列の相補配列の2番目の塩基から翻訳していきます(入力した配列の後ろから2番目の塩基から翻訳されます)
--- -3:入力した配列の相補配列の3番目の塩基から翻訳していきます(入力した配列の後ろから3番目の塩基から翻訳されます)
--- Reverse three frames:上記3つの翻訳を一度に実行します
--- All six frames:すべてのフレームを一度に翻訳します

--Code to use で翻訳コードを指定します(ミトコンドリアの遺伝子などは通常のコドンテーブルが使えない場合が多いです)

--Regions to translate で翻訳する領域を指定できます


-【課題】: 演習用配列1をアミノ酸に翻訳しなさい。全てのフレームで翻訳するとどうなるか?

**Primer3でプライマーを設計する [#j2f18ab0]
-統合TV:[[Primer3でPCR用のプライマーを設計する>http://togotv.dbcls.jp/20070824.html]]

-[[Primer3>http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi]]

--左上にある「Task」から目的にあわせてプライマー設計が可能
---Detection: 通常のPCR用プライマー
---Cloning: フレームを指定してクローニングしたいとき用
---Sequencing: シーケンス用のプライマー(プライマーの間隔とかを調整)
---Primer List: 見つけたプライマーのリストを表示
---Primer Check: プライマーの長さ、tm値、GC含量などを計算

--「Main」タブ
---Excluded Regions: <> で囲んだ配列からはプライマーを設計しない
---Targets: [] で囲んだ配列を含むようにしてプライマーを設計する
---Included Region: {} で囲んだところからプライマーを設計する

--「General Setting」タブ
---プライマーの長さ、Tm値、GC含量の範囲などを指定できる

--「Advanced Setting」タブ
---分子内にいくつまで相補的な配列を許すか、などを指定できる

--右上の「Pick Primer」でプライマーを設計する

-演習用配列2(ost4とその上流、下流のDNAを含む:全長をクローニングする際には遺伝子の前後の配列が必要となる)
 >YDL232W  Chr 4
 TGCAAGTCAGTAGAGAAACCCAGTACAGAGCAAGCAAAAGATGATCTCTGATGAACAGCT
 GAACTCCTTGGCCATCACCTTCGGTATTGTGATGATGACTTTAATTGTCATTTACCATGC
 TGTTGACTCCACCATGTCTCCTAAGAACTAAAGTGGTTACATTTGGATAGCGAACTTCAG

-【課題】: ost4をコードしている部分を増幅するプライマーを設計せよ。
--今回はフレームは考えないことにするので、Task: はDetectionにする
--演習用配列1を参考にしてコードされている部分を[]で囲う
--パラメータは初期設定で

-解答
--&color(white){5'末端側のプライマー:CCCAGTACAGAGCAAGCAAA};
--&color(white){3'末端側のプライマー:TTCGCTATCCAAATGTAACCA};
 増幅される配列:
 CCCAGTACAGAGCAAGCAAAAGATGATCTCTGATGAACAGCTGAACTCCTTGGCCATCA
 CCTTCGGTATTGTGATGATGACTTTAATTGTCATTTACCATGCTGTTGACTCCACCATG
 TCTCCTAAGAACTAAAGTGGTTACATTTGGATAGCGAA};

***ベクターに導入するために増幅する配列の両末端に制限酵素認識サイト(のりしろ)をいれます [#v1f9e25b]
-今回は[[pUC18>http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?unitid=U100003189]]という発現ベクターを使ってみます
-制限酵素は EcoRI, BamHI, HindIII あたりがよく使われます
--EcoRIの認識配列: GAATTC
--BamHIの認識配列: GGATCC
--HindIIIの認識配列: AAGCTT
-これらの配列をのりしろとして使うには、増幅された配列がこれらの酵素で切断されない必要がある


**NEBcutter [#id2dd784]
-統合TV:[[NEBcutterでDNAを切り倒す!>http://togotv.dbcls.jp/movie/071107NEBcutter_f.html]]

-[[NEBcutter>http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php]]

-【課題】:設計したプライマーによって増幅される配列が、EcoRI, BamHI, HindIIIで切断されるかされないか確かめてみよう
--入力ボックスに増幅される配列をコピー&ペースト
--左下のチェックボックスで入力した配列が直鎖か環状か指定
---PCR増幅産物はLinearなのでLinearを選択
--右側のチェックボックスで制限酵素リストを指定
---NEB enzymes: NEW ENGLAND BioLabs社で売っている制限酵素
---All commercially available specificities: 売られている制限酵素
---All specificities: 今まで発見されている制限酵素
--「submit」で制限酵素切断部位を検索
--初期状態では配列を1ヶ所切断する制限酵素が表示される
---入力配列を''切断しない''酵素のリストは、「0 cutters」から見ることができる

-配列を切断する酵素を使って、設計通りに正しく配列が増幅したか?を確かめることができる
--左下「Main Options」の「Custom digest」から、切断に使う酵素を選択
--例えば「HincII」という制限酵素にチェックを入れて、一番下にある緑色の「Digest」をクリックするとHincIIの切断部位が表示される
---「View gel」をクリックすると、電気泳動したときにどのようになるかを表示できる
---電気泳動の画面ではゲルの種類を選んだり、マーカーを同時に表示させたりもできる


***増幅配列を切断しない酵素がわかったら、どの制限酵素を使うか考えます [#v4ce1090]
-プライマーの5'末端側に制限酵素の認識配列を追加します
--プライマーの長さ、Tm値、GC含量なども考慮しながら考える


***プライマーのtm値計算ツール [#p5c7a028]
-http://www.m-neko.net/tm_calc/
-http://www.research.kobe-u.ac.jp/brce-mikitani/tm.html
-http://www.riken.go.jp/lab-www/help2/members/kagawa/tmnumber.html

などなど
--何種類か計算方法があるのでいろいろな値が出てくる。
---同じ計算方法で同じくらいのtm値になるのが理想

**ベクターにPCR増幅産物を入れたらどうなるか見てみます [#na903a1a]
-NEBcutterのトップページに戻って、灰色の箱の右上にある「Standard sequences:」から、pUC18を選んで「Submit」します
-マルチプルクローニングサイトの部分を拡大して見てみると、なんと遺伝子が読まれる方向とは逆方向に配列が登録されています。これはひどい
-しかたがないので、増幅した配列の相補配列を作ります

**revseq [#a59ee800]
-EMBOSS の revseq を使うと、相補配列、逆配列などを作成できます
--Complement sequence? を Yes にすると、相補配列に変換できます。ただし、このままでは配列が 3' → 5' の方向を向いています
--そこで、Reverse sequence? を Yes にして、5'と3'を入れ替えます
-これで''高いソフトを買わなくても''相補配列を手に入れることができます

***それではコンピュータの中で増幅配列をベクターの中に入れてみます [#p193ebc6]
-メモ帳などを使ってコピー&ペーストで配列を切ったり貼ったりする
--NEBcutter pUC18のページで「View sequence」をクリックするとベクターの配列がわかります
--フレームがずれないように気をつける
-増幅した配列を1カ所、ベクターを1カ所切断(出来上がったプラスミドでは2カ所切断)する制限酵素を使うと、正しい方向で増幅配列がベクターに入ったかどうかわかります
--例えば CjuI という制限酵素でプラスミドを切ったとき、正しい方向に配列が入っていれば 2539 bpと275 bpの断片ができるはずです。逆方向に入ってしまった場合は 2504 bpと310 bpの断片ができます

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